ELISA中的試劑－酶的底物 
 
酶的底物
3.3.1 　HRP的底物
HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3,3\\',5,5\\'-tetramethylbenzidine, TMB）和ABTS[2,2\\'-azino-di-（3- ethylbenziazobine sulfonate-6）]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD•2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈，可在比色計(jì)中定量，zui適吸收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些盒所采用。
另一種HRP的底物為3-（4-羥基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。
HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物（urea peroxide）。H2O2應(yīng)用zui多，但尿素過(guò)氧化物為固體，作為較H2O2方便、穩(wěn)定。盒供應(yīng)尿素過(guò)氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。
3.3.2　AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP）作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，可穩(wěn)定一時(shí)間。
AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。
3.4 　洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
3.5 　酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的zui終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
3.6　陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品
陽(yáng)性對(duì)照品（positive control）和陰性對(duì)照品（negative control）是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國(guó)外盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿（recalcified human plasma）為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，抗HBs也是陰性。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量在說(shuō)明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與的敏感度相稱，在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。